Nació en Nuevo Hampshire, pero su familia se trasladó pronto a Cleveland, después de la muerte de tres de sus hermanas por la escarlatina. Woolson se educó en el Cleveland Female Seminary y un internado de Nueva York. En 1870 comenzó a publicar relatos de ficción y artículos en revistas como «The Atlantic Monthly y Harper's Magazine». Viajó ampliamente por el Sur, lo que le dio Material para sus historias cortas. En 1879, marchó a Europa y permaneció en una serie de hoteles de Inglaterra, Francia, Italia, Suiza y Alemania. En 1880 conoció a Henry James y la relación entre ellos ha suscitado gran especulación por parte de los biógrafos. En 1893 Woolson alquiló un elegante apartamento en el Gran Canal de Venecia. Enferma de gripe y depresión, se cayó o se tiró desde una ventana del apartamento en enero de 1894 y murió. Se encuentra enterrada en el Cementerio Protestante de Roma.